代谢在细胞和生理过程中的作用已经很明确，现在认为许多疾病都与代谢功能障碍或重编程有关。安捷伦 Seahorse XF 技术简化了细胞能量代谢分析。该技术利用免标记方法实时测量活细胞的两条能量代谢通路，量化细胞代谢表型，从而分析细胞功能的变化。

     XF 技术通过测定氧气消耗速率(Oxygen Consumption Rate, OCR)来反映细胞线粒体的功能，通过测定细胞外酸化速率(Extra Cellular Acidification Rate，ECAR)来反映糖酵解功能。

     将细胞接种到孔中，并可以将多四种药物（例如抑制剂或激动剂）自动添加到细胞中。在探针板中，每个探针四周排列了四个集成的加药口。将药物依次注入孔中，并通过探针与检测液混合。实时测定药物诱导的细胞代谢动态变化。

提问

Qustions&解答Answers

Seahorse XF 实验常见问题及解答

01可以使用超出保质期的探针板或重复使用探针板吗？

     Agilent 无法保证因使用超出保质期的探针板或重复使用探针板而得到的实验数据质量(有效性)，为得到较佳的、较真实的数据，请使用有效期内的探针板及其它消耗品。

02探针板水化超出水化时间怎么办？

     Agilent建议将探针板放入37℃无CO2培养箱中水化过夜以得到较优结果。短水化时间是37℃水化12小时。探针板长水化时间是37℃水化72小时，但由于液体蒸发需要补充(或更换)校准液，因此37℃无CO2培养箱务必放置水盘保证湿度。

03Fluxpak各种探针板有什么区别？

     探针板是Fluxpak的组成部分，一个Fluxpak包含探针板、水化板、校准液和细胞培养微孔板。以上各消耗品数量因所购Fluxpak类型而不同。探针板不能单独订购，必须通过订购Fluxpak来购买，但细胞培养板和校准液可单独购买。订购前，需要了解使用机器的型号及所需要的实验次数，订购与之配套的Fluxpak。

04计划明天做实验，我今天要做些啥？

     实验前一天，打开主机，打开电脑，同时点开Wave软件，确保是Connected的状态，水化探针板，贴壁细胞提前接种到Seahorse的细胞培养板里。

05探针板水化听说有二步，是这样吗？

     是的，96孔探针板，实验前一天，用无菌水；第二天做实验前，弃去无菌水，更换上37℃预热好的校准液，再放置无CO2恒温箱孵育1小时，这样二步法水化，较大程度避免了探针头上的小气泡；24机型探针板一步法水化即可，但是还是建议用之前手动排一下气泡；

06一次实验可以只使用探针板其中的一部分吗？

     为了将所有药物或化合物成功地注入细胞培养孔中，Agilent建议水化整个探针板并因需要将相同字母标注的全部加药孔注入药物（请参考实验流程中关于加载药物的注意事项）。背景孔的加药孔也必须加上药物，保证所有的A加药孔体积一致，B、C、D孔同理，否则会造成打药失败；

07实验中为何必须设置背景校正孔？

     背景校正孔被用来过滤掉实验的干扰因素，比如温度和 buffering capacity，这些干扰因素会影响氧含量和pH变化（非来源于代谢变化的影响）。背景校正孔还能被用来修正整板间温度波动，来诊断潜在温度问题，以及作为实验获得非期望数据时原因筛查的切入点。

08背景校正孔怎么设置？

      背景校正孔里除了没有细胞，其它所有操作和细胞孔一致。96机型背景校正孔（A1,A12, H1, H12，即4个角）不接种细胞；24机型背景校正孔设置为（A1, B4, C3, D6）；确保背景校正孔中只加入培养液（无细胞）

09为何细胞培养板需要在 37℃无CO2 培养箱中放置45-60min？

     细胞培养板在37℃无CO2培养箱中孵育45-60min的目的是为了脱气，释放CO2。

10 Seahorse 实验时，我担心细胞量少，我多种点细胞可以吗？

     细胞的密度需要摸索，在实验上机前，长满板底面积80-90%为较佳，设置一个密度梯度，找到较佳的密度；细胞过密会使检测时形成的瞬间微室氧气快速耗尽。

11 Seahorse 实验，种细胞和平时种细胞有区别吗？

      安捷伦细胞培养板种细胞时候，枪头抵壁，与水平面呈45°角度加入，加完在超净台静置1小时，有助于促进细胞均匀分布并减少边缘效应。96孔细胞板种80ul；24机型的板子分二步，先每孔接种100 μL细胞悬液，培养细胞1-6小时，细胞贴壁后，再补充生长培养基，每孔加入150μL生长培养液,总体积为250 μL。加液时沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。 

12 使用组织黏附剂处理细胞培养板会影响XF实验测量吗？

     不会。使用诸如poly-L-Lysine，fibronectin，Gelatin，poly-D-lysine，Cell-Tak™等组织黏附剂处理细胞培养板时，不会影响XF仪器测量的效果及实验参数分析。

13 XFp/XFe96细胞培养微孔板的每个细胞孔的大体积及底面积是多少？

       275 µL；底面积是正常96孔板底面积的40%。

14 XFe24细胞培养微孔板的每个细胞孔的大体积及底面积是多少？

      1000 µL；底面积和正常96孔板底面积一样大小。

15 Seahorse XF检测液中需要加入抗生素吗？

      无需加入抗生素，因为大部分XF实验在几小时内就结束了。

16可以在Seahorse检测液中加入血清吗？

      不建议加入血清（如：FBS），因为其会影响检测液的缓冲能力，并可能与进行检测的药物/化合物发生非特异性结合而影响检测效果，同时容易产生气泡。另外，使用加入血清的检测液溶解药物加载至探针板加药孔中进行注射时，会出现漏药或加药注射失败。

17加入底物的检测液在多长时间内可保持稳定？或可以提前配好检测液和药物吗？

      Seahorse检测液在实验当天现用现配。药物也要现配现用，溶解后的药物要一次性用完，剩余的也不能用于下次实验了。

18 Seahorse XF糖酵解压力试剂盒中的药物状态看上去很奇怪，是否有质量问题（或其他试剂盒中部分药物）？

      如Glycolysis stress test kit中的2-DG，该药可能是透明的液体、不透明的（白色的）固体，也可能是白色固体与透明液体的混合物，以上药物状态均不影响其性能，可按照说明书正常溶解使用。

19使用pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 基础培养基制备检测液时，加上Seahorse的三个底物，是否就无需调整pH了？

      是的。使用推荐的 XF 三个底物，能确保分析培养基终 pH 值的准确。如果使用其他供应商提供的其他品牌的补充剂，则无法保证培养基pH 值的准确。启封后的pH7.4的DMEM或RPMI基础培养基，尽可能在一个月内用完，以免pH值因为空气中的CO2进去，影响pH值。

20Seahorse的基础培养基与其他厂家的有啥不同？

       Seahorse XF 培养基于 XF 分析，推荐研究者使用，以获得较佳试验结果。XF 培养基以标准细胞培养基组分（DMEM 或 PRMI）为基础，做了以下这些方面改进：

 无碳酸氢盐和低缓冲容量：利于细胞外酸化率的检测 

 无底物添加：适用于用户的各种不同需求 

 低浓度酚红或无酚红：确保 pH 值测量的准确性 

21请问进行FAO实验时，能够在探针板上加载BSA-palmitate使其在上机测量时自动注射入细胞孔吗？

      Agilent建议将BSA-palmitate或相似底物在培养细胞时做预处理。如果实验存在合理依据需在上机测量时通过注射加BSA-palmitate、血清或其他类似底物，请联系相关技术支持。

22 为何不能使用XF base medium配制的检测液进行Glycolytic rate与real-time ATP rate两个实验？

      XF base medium中含有酚红，该物质会影响这两个实验的测量。

23 为何不能使用GlutaMAX来代替Glutamine呢？

     不建议使用GlutaMAX来配制检测液。因加入GlutaMAX后，还需细胞进一步将其转化为glutamine，这可能会影响线粒体对Glutamine氧化的动力学过程。

24 检测液的pH对XF实验非常重要吗？

    是的，Seahorse XF实验通过测定细胞代谢物（如：氧和质子）的变化来确定OCR 和ECAR，而检测液pH会影响这些代谢物的产生或消耗，因此保持检测液一致的 pH（37℃，pH=7.4± 0.1）非常重要。

25 FluxPak中的水化板可以替代细胞培养板吗？

      不可以，虽然水化板与细胞培养板结构相同，但不能用来培养细胞。

26 Seahorse 探针板上机前加药，需要注意什么？

       加药时同样方法，枪头抵着加药孔壁大约与水平面呈45°度角，将液体一次性加入到加药孔中，注意板子始终保持在平面上，加完药的探针板不能晃动，以免加入的液体漏入水化板中。（24的机型，在加药前需要取下粉色的水化辅助板）；

27 Seahorse 细胞板上机时候，放进去应该就可以了？

       探针板和细胞板放入仪器时，朝向为A1孔朝向机器内部，记得把盖子拿掉；

28 Seahorse XF报告生成器中的代谢数据是如何计算的？

      在每个试剂盒的Seahorse XF报告生成器的用户指南中详细列出了数据的计算公式，请参阅。

29 Seahorse数据分析软件Wave可以免费下载安装吗？

      是的，可在安捷伦找到Wave软件下载，并且免费下载安装。

30 Seahorse XF 仪器模板选项中没有想检测试剂盒的模板怎么办？

     可在桌面板wave软件中将相应实验模板先导出到 U 盘中，再导入XF 仪器模板库即可。

31 Seahorse数据分析软件导出选项中没有对应的report generator？

      当软件导出选项中无相应的report generator时，请移步到Agilent细胞分析软件下，下载wave分析软件，也可以在对应试剂盒的菜单中下载对应的report generator。

32 Seahorse Wave 分析软件，我的电脑怎么都安装不上，怎么办？

     当软件无法安装时，可采用 Seahorse Analytics云分析， 这是一款网页形式的 Seahorse XF 数据分析软件，用户可以通过任何一台电脑安全地存储、访问和分析数据。较大地简化了用户的数据分析流程

33 Seahorse XF 实验后，是否需要做归一化处理呢，有哪些方法呢？

     功能生物数据的归一化是原始数据展示和后续分析工作流程中的关键因素，以确保对结果的准确一致的解析。XF 代谢分析在这方面也是如此，大多数实验需要进行某种形式的归一化。无论是比较不同的细胞类型、基因修饰还是化合物处理，都必须根据共同的参数将数据归一化以便正确比较。

     常用的方法，蛋白定量，细胞成像计数，核DNA的检测等。

34 购买的Fluxpak包装，为啥细胞板总是多几块呢？

    Agilent 充分考虑到实验中的各种情况，如果你发现细胞种的过密了或者发生了污染，那么就需要更换新的细胞板重新铺板。

35 Seahorse相关试剂存储条件是怎么的呢？

      Agilent 基础培养基类，请4℃避光保存，避免冻结。FAO和谷氨酰胺需要存放在-20℃；板子及常见的试剂盒，室温存储即可。

36 Seahorse XF 相关试剂盒的说明书在哪呢，有中文的吗？

   Agilent 一直提倡遵循环保理念，当您收到试剂盒后，标签面都有一个二维码，扫描即可下载说明书。部分有中文说明书，请联系相关技术支持索取。

37 Seahorse XFe24 组织胰岛板能简单介绍下吗？

     目前只要24机型配有组织胰岛微孔板，其微孔板的腔室容积为16.6 µL；

其网状捕获筛孔径为125 µm。

38 Seahorse 啥数据能大致判断实验结果靠谱不？

      通过大量的结果数据，24机型基础OCR值范围50～400(pmol/min)，基础ECAR值范围20～120(mpH/min)；96机型基础OCR值 范围20～160(pmol/min)，基础ECAR值范围10～90(mpH/min)。这个范围内的值，还是比较靠谱的。

3 Seahorse  24/96 孔微孔板的尺寸是多少？